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细胞培养、细胞传代、细胞冻存以及细胞复苏小攻略

1188 人阅读发布时间:2019-08-07 15:50

细胞培养、细胞传代、细胞冻存以及细胞复苏小攻略
一、耗材、试剂预备

1、玻璃移液管:泡酸过夜,洗涤干净之后用单蒸水清洗一遍,然后在 75 ℃ 烘箱过夜烘干,在管尾塞入脱脂棉,放入不锈钢灭菌筒灭菌(120 ℃,30 min),不锈钢灭菌筒贴上灭菌标签,灭菌完成后烘干备用(高压灭菌条件一致为 120 ℃,30 min;烘干条件一致为在 75 ℃ 烘箱过夜)。

2、移液枪头:按规格装入相应的枪头盒,贴上灭菌标签,高压灭菌,灭菌完成后烘干备用。

3、PBS 缓冲液:配制好的 PBS(pH=7.4),用 0.45 μm 滤膜过滤,高压灭菌,注意液体试剂在封闭容器中灭菌时将容器盖拧松,待灭菌完成后再旋紧,放入冰箱 4 ℃ 备用。

4、培养基配制:一般细胞培养都用10%体积浓度的胎牛血清的RIMP-1640或DMEM培养基,加入双抗(青霉素、链霉素 C0222,碧云天),配制时在超净台里操作,配制好以后放入 4 ℃ 备用。

5、0.25% 的胰酶消化液:0.25 g 胰酶(T4799-100G,Sigma)+100 mL PBS(PBS 最好过 0.45 μm 的滤膜)+0.168 g EDTA,待溶剂溶解以后在超净台过 0.22 μm 的滤膜。

6、细胞冻存液:通常为细胞培养液如 RPMI-1640 + 30% 血清 + 10% DMSO(D2650,Sigma)。
 

二、培养前预备

1、将所需耗材如移液器、离心管架、移液管、Tip、培养器皿等经酒精消毒(喷雾)后放入超净台,紫外照射 30 min。

2、培养基、PBS、胰酶消化液等试剂先温浴到 37 ℃,经酒精消毒(喷雾)后放入到超净台。


三、细胞培养

1、原代细胞培养

分离取得的原代细胞用 PBS 洗涤,1000 rpm 离心 5 min,洗涤两次,然后加入适量培基,37 ℃,5% CO2 孵箱培养。

原代细胞培养所需的耗材如培养瓶、离心管(NUCN)最好使用一次性的。

2、细胞株培养与传代

贴壁细胞培养传传代:贴壁细胞先弃去旧培基,在消化前先用PBS在培养器皿中洗涤 1 次,尽量弃去 PBS 后加入适量胰酶消化液(通常 1-3 ml 即可)。左右晃动培养皿/瓶使胰酶覆盖流过整个培养面后,放入孵箱 2-5 分钟,期间注意观察。在显微镜下观察细胞收缩后,加入新培基终止消化。可轻微拍打培养瓶,加速细胞脱落。

悬浮细胞培养传代:移液管吹打细胞收集到离心管中,若是悬浮细胞吹打重悬后移入离心管(无胰酶消化步骤),1000 rpm 室温离心 5 min,弃去上清,加入适量培基重悬,细胞计数后吸取所需细胞到培养器皿,补加培基,37 ℃,5% CO2 孵箱培养。


四、细胞冻存与复苏

1、细胞冻存:需冻存的细胞经过传代步骤后,重悬于冻存夜,转移到冻存管(通常 1 mL/管,不少于 2*106 细胞),放入冻存盒保存 -80 ℃ 冰箱,过夜后移入液氮。

2、细胞复苏:一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入 37 ℃ 水浴中,使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰室,迅速将细胞转移到含 9 ml 冷的培养基中(先将之置于 15 ml 离心管中,放于冰上)。1000 rpm 室温离心 5 min,弃去上清,加入适量培基重悬后将细胞转入培养器皿中进行培养。


细胞培养注意要点:
• 细胞培养应严格遵守无菌操作规范,所用一切试剂及耗材均为无菌。
• 细胞培养的关键点在与细胞培养的密度,传代时细胞密度不能过低,否则影响细胞间信号传递,最终会导致细胞状态不好;细胞培养到一定密度时,需要传代,一般贴壁细胞看细胞融合到 80% 就可传代,而培养悬浮细胞时,可通过看培养基颜色以及细胞密度来判断是否传代。
• 在培养传代过程中,需要用移液管吹打处理细胞,此时应尽量避免气泡的产生,否则产生的剪切力会对细胞有损伤,最终影响细胞状态(吹打过程中可以残留部分液体在移液管内,以减少气泡的产生)。
• 细胞洗涤离心的时候,离心力的选择一般是:原代细胞离心 300-500 g/5 min,肿瘤细胞200-300 g/5 min。离心力过小收集到的细胞数量不够,离心力过大对细胞有损伤。
• 离心后的细胞沉淀弃去上清后,先弹散细胞沉淀,后加入培养基重悬铺板,这样比直接吹打细胞沉淀对细胞损伤小,提高传代后细胞活率。
• 细胞培养基应先在 37 ℃ 温浴后使用,可以分装每次需要的量来温浴,避免反复温浴对培养基性能的影响(特别是含有蛋白或者细胞因子的培养基)。


美国 PeproTech (派普泰克)公司成立于 1998 年,总部位于美国新泽西洲。 PeproTech 公司是世界上最大的重组细胞因子和蛋白生产商之一,共生产 500 多种重组人、小鼠、大鼠细胞因子和蛋白,因其较高的性价比而受全球各实验室的青睐。

PeproTech Inc. 的产品涵盖免疫调节蛋白、白介素、集落刺激因子、生长因子、化学趋化因子、干扰素、脂联素、成纤维生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、神经营养素和防御素等诸多生命科学研究领域中重要的生物活性分子。2014 年 PeproTech 推出流式品牌 BioGems, BioGems 目前已有一千多种流式产品,涵盖多种荧光标记的流式抗体、具有生物活性的功能性抗体,以及流式细胞术辅助试剂,如溶血剂和破膜剂等,并不断有新产品发布。
资料格式:

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