单核细胞,是白细胞中体积最大的细胞，直径(15-20µm)大于淋巴细胞（6-20µm），密度比淋巴细胞略小,呈圆球形。来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，当它们从骨髓进入血液时仍然是尚未成熟的细胞。目前认为它是巨噬细胞和树突状细胞的前身。

这里给大家分享使用OptiPrep^™多功能分离液(cat#1114542, AS)从人全血样本、富白细胞血浆中分离单核细胞的实验方法。

 

一

从全血中分离出富含单核细胞的组分

1. 溶液准备：

溶液A：OptiPrep^™ (60%, w/v iodixanol)，使用前轻轻摇晃均匀；

溶液B：8.5% (w/v) NaCl；

溶液C：常规培养基+10% FBS (如RPMI或DMEM)。

2. 分离步骤：所有操作都使用聚丙烯管

（1）使用EDTA抗凝管收集10 ml血液样本；

（2）配制1.070 g/ml (溶液A + C = 11.8 + 48.2)或1.072 g/ml (溶液A + C = 12.2 + 47.8)或1.074 g/ml (溶液A + C= 12.6 + 47.4)的密度梯度分离液（Notes. 1）；

（3）配制54% (w/v)碘克沙醇溶液：5.4体积溶液A + 0.6体积溶液B；

（4）将2 ml 54%碘克沙醇溶液与10 ml血液样本轻轻混匀；

（5）在15 ml离心管中依次轻轻加入4 ml稀释后的血液样本、6 ml步骤2中配制的密度分离液、0.5 ml溶液C，注意保持液面间界面清晰；(见下图)

（6）水平转子700×g离心30 min，20℃，注意离心机应缓升缓降；

（7）收集漂浮在分离液层顶部的单核细胞，该条带可能非常分散，占2-3 ml；(见下图)

Notes：

① 上层分离液的密度选择一定程度上取决于实验者的需求，使用1.072 g/ml进行分离，获得的单核细胞纯度约为85-90%(酯酶染色评估)，但产率仅为约30%，1.074 g/ml可以回收更多的单核细胞(约占总数的60%)，但淋巴细胞污染比例较大(纯度为约80-85%)，1.070 g/ml暂未调研；

② 此方法适用于来自健康人的EDTA抗凝新鲜血液样本(＜2 h)；

③ 将离心时间增加到40min一定程度上可以提高单核细胞的产量。