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免疫染色5-封固样品、观察及FAQ

人阅读 发布时间:2019-08-28 10:36

免疫染色5-封固样品、观察及FAQ

染色及复染进行完之后,为了有利于样本长期保存,方便后续观察,需要进行的是对样本进行封固。IHC使用的封固剂包括水性封固剂和非水性封固剂(如中性树脂等)。如选用非水性封固剂,在封固之前需要对样本进行脱水处理,方法为95%乙醇中脱水2次,每次10秒;100%乙醇中脱水2次,每次10秒;二苯中脱水2次,每次10秒。因为二苯有毒且易挥发,这一步骤需在通风橱中进行。脱水处理之后,将封固剂滴在载玻片一端,之后缓慢盖上盖玻片即可,盖玻片周围可用指甲油进行密封。IF实验需注意使用的封固剂需含有抗荧光淬灭剂,以保证荧光信号长期可观察。

 

七.观察和成像

观察和成像是获得良好实验结果的最后一步。对于IHC实验结果,一般选用显微镜在明场下进行观察,找到信号特征较好的位置后,进行图像采集。IF的荧光结果,需注意调节荧光显微镜参数,选好激发光波长以及信号采集波长范围,更需要酌情调整参数,确保信号强度以及信噪比,获得良好的图像结果。

 

八.实验疑难排解

 

1.IHC/ICC疑难排解

问题/现象

可能的原因

改善方法

 

 

 

 

 

 

无染色

一抗和二抗不匹配

使用抗一抗的二抗(如一抗来自兔,二抗未抗兔抗体)

没有足够一抗与目标蛋白结合

使用低稀释度抗体,延长孵育时间(4℃过夜)

抗体天然结构(3D形态)受损不适用于IHC

用天然(非变性的)WB法检测抗体,确保抗体未受损坏

由于储存不当、稀释或反复冻融造成抗体失效

做阳性对照确认一抗、二抗试剂盒的有效性

靶组织中没有目标蛋白

参照抗体供应商的建议做阳性对照

组织中没有足够的目标蛋白

应用信号放大操作

二抗未避光保存

避免二抗受光照

脱蜡不彻底

延长脱蜡时间,更换二苯

固定步骤(使用福尔马林和多聚醛固定剂)修饰了抗体识别表位

抗原修复法暴露出抗原表位,缩短固定时间

蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜

封闭液和抗体稀释液中加入通透剂

PBS缓冲液被细菌污染,破坏了靶蛋白的磷酸根

于PBS储存液中加入0.01%叠氮化合物,或使用新鲜无菌PBS

 

 

高背景

封闭不充分

延长封闭时间,考虑更换封闭剂。建议使用10%正常血清封闭切片1h或1-5% BSA封闭培养细胞30 min

一抗浓度过高

降低抗体浓度,在浓度较低抗体中延长孵育时间

孵育温度过高

4℃中孵育切片或细胞

二抗发生了非特异性结合(被损坏)

增加对照组,排除二抗的非特异性结合可能性

固定剂残留

使用PBS充分清洗

高背景

存在内源性过氧化物酶活性

使用酶抑制剂,如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM),或抑制过氧化物酶的H2O2

固定过度(固定剂用福尔马林和多聚醛)导致抗体识别抗原位点被修饰

改变抗原修复方法,缩短与抗原修复液的孵育时间

信号过度放大

缩短信号放大时间、孵育时间,稀释信号扩大试剂盒

底物过量(酶检测法)

缩短底物孵育时间

染料与PBS在细胞/组织中相互作用(酶检测法)

用Tris缓冲液冲洗切片后,再与底物孵育。孵育后,Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片

通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

去除缓冲液中通透剂

非特异性染色

一抗、二抗浓度过高

降低抗体浓度,缩短孵育时间

存在内源性过氧化物酶活性

使用酶抑制剂

一抗与被染组织同源,加二抗后,二抗会与同源的所有组织结合

使用与组织非同源的一抗

切片/细胞变干

保持切片/细胞湿度,切勿变干

 

2.IF疑难排解

问题/现象

可能的原因

改善方法

信号弱或无信号

样品保存不当,荧光基团在光线下暴露时间过长,导致信号衰减

避光条件下进行保存和孵育样品。可在防淬灭溶液中封固样本。样本封固后立即采集图像,以获取最佳结果。

细胞、组织样本保存时间过长

使用新制备的载玻片/板,以避免丧失抗原。

 

固定不足

建议操作步骤:处理后立即移除介质并在固定剂中快速/彻底地清洗。对于磷酸化特异性的抗体,使用浓度为至少4%的醛来抑制内源性磷酸酶。

抗体稀释浓度过低

使用产品册建议稀释浓度。

抗体孵育时间不恰当

使用产品册建议操作步骤进行一抗孵育。

检测系统不适用

在可能的情况下,使用蛋白印迹法或其它方式来确认表达蛋白。

诱导靶蛋白不恰当

针对每种靶标确定各自最佳处理条件和对照。

目标蛋白表达较低

调整检测方法;考虑信号扩增,或与更亮的荧光基团配对。

通透方法不正确

使用产品册建议操作步骤。

二抗适用不当

使用产品册建议稀释浓度使用;检查二抗与一抗宿主的物种匹配。

激发波长适用不正确

确保激发和检测与荧光基团激发光波长相匹配。

 

多重IHC中信号较弱

优化脱蜡、抗原修复、信号扩增方法。

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