问题/现

可能的原因

改善方法

封闭不充分

延长封闭时间，提高封闭剂浓度或考虑更换封闭剂

抗体浓度过高

稀释抗体浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间

二抗与封闭剂非特异性结合

设置二抗对照（不加一抗）

背景高

一抗或二抗与封闭剂有交叉反应

在孵育和清洗中加入温和去污剂（吐温-20）;脱脂奶粉中含有磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而产生高背景，用BSA作封闭剂

清洗不充分

增加清洗次数和时间

膜干燥

全程膜要保持在充分的反应液中

胶片曝光过度

缩短曝光时间和化学发光底物反应时间

蛋白与膜的非特异性结合

确保使用干净的转印设备和高质量的试剂等

问题/现象

可能的原因

改善方法

背景有不均匀白斑

转膜时膜上有气泡

转膜操作时注意不要留有气泡

抗体孵育时与膜接触不充分

抗体孵育时保持

背景有黑斑

抗体结合了封闭剂

过滤封闭剂