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免疫荧光技术测定法
人阅读 发布时间：2012-05-08 14:08
Coons等于1941年合成了异氰酸荧光黄(FIC)，能有效地标记抗体球蛋白而不损害抗体的活性，但标记困难，不易普及。其后，于1958年又成功地合成了异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiocyanate, FITC)，它既易与Ig形成稳定的结合物，又不影响Ab的活性，从而使得免疫荧光技术得到了迅速推广，几经改进简化，现又出现了吖啶橙免疫荧光法(AOFA)和荧光标记A蛋白试验等。现将其分别简介如下：
(一) 荧光抗体检测法(fluorescence antibody assay)
是应用FITC或罗丹明B(lissamine rhodamine B,RB200)等与提纯的抗体球蛋白相结合，制成所谓的荧光抗体，然后将其滴加于事先涂好被检抗原标本的载玻片上，经过一定时间染色，冲洗后，再用荧光显微镜做检查的一种方法(直接法)。如在被检标本中存在相应的微生物，则发生特异的抗原抗体反应，在荧光显微镜的视野内，不但可以看到典型形态的微生物，而且在微生物上还可以看到发出特异的草绿色荧光，由此可对被检标本作出诊断。
荧光抗体检测法在实际工作中还可根据自身条件，采用间接法。直接法操作虽比较简单，特异性较高，但敏感性稍低，适用于对相应微生物的直接检测。间接法的操作较复杂，但可以只用一种标记了荧光素的抗IgG的免疫球蛋白检测多种微生物，其敏感性较直接法约高10倍，但易产生非特异性荧光。另外，还有所谓的抗补体法，但在检验工作中应用的不多。
由于荧光抗体技术日趋完善，已成为一项既准确又快速的诊断技术，尤其是检测含微生物少，污染严重的标本时，更可显示出其独特的优点。本法主要用于炭疽、猪丹毒、布鲁氏菌病、鼻疽、沙门氏菌病、猪瘟、猪水泡病、马传贫、流乙脑炎等的快速诊断。另外，也可用以检查病原微生物在机体内的分布，血清抗体的滴度等。
(二) 吖啶橙免疫荧光法(AOFA)
用高倍稀释的吖啶橙溶液(1∶8万～1∶16万～1∶100万)与2～4单位的特异免疫血清等量混合后制成的诊断液，用其着染被检标本，如其中含有相应细菌，则与诊断液中的抗体结合，并产生特异的荧光，特别是细菌被抗体凝集成菌团后，用高稀释度的吖啶橙液仍可使细菌明显着色，然后以1 000r/min离心5～10分钟，取沉淀物倒于玻片上，用低倍荧光显微镜观察荧光菌团现象，当看到疏松，边缘不整齐，呈淡绿色的荧光菌团，大小在1mm以上者为阳性，然后用白金耳挑取荧光菌团作进一步的培养鉴定。
本法是在血清学的特异性和荧光法的敏感性基础上，与分离培养相结合而建立的一种方法，并且又通过低速离心沉淀和高度稀释的荧光色素的作用，加速了凝集，既能达到增大细菌凝块，又可减少类属抗原抗体交叉凝集反应的目的，并由于抗原-抗体的选择性凝集作用，而排除了标本中杂菌及杂质的干扰，并且能从荧光菌团中分离到活细菌，以作出确切的诊断，因而增加了本法的特异性、敏感性和快速性。根据荧光菌团作为初筛预报结果，可以在30分钟内完成，从荧光菌团分离培养至作出确切诊断，可在14～18小时内完成，比常规培养法提前20～30小时；用此法分离到细菌的阳性率，比常规法高3倍左右；此外本法不用提取Ig，与免疫血清混合、制成诊断液即可，方法简单，且易长期保存。本法已用于猪丹毒菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌及产气荚膜杆菌的检验。
(三) 荧光标记A蛋白(FITC-SPA)检测法
SPA是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种主要成分，它能与多种正常哺乳动物的IgG的Fc片段结合，而不影响该抗体分子的免疫活性，仍能与抗原起反应，当用荧光色素将其标记后，可制成特异的诊断制剂。在常规的荧光抗体技术间接染色法中，必须使用第二抗体(即抗球蛋白抗体)，但由于动物的种类不同，需要使用抗各种动物的第二抗体(如兔抗猪球蛋白抗体、兔抗马球蛋白抗体等)和抗各种动物球蛋白的荧光抗体，这样不仅操作复杂，同时也容易出现类属反应。而SPA能与多种哺乳动物的IgG的Fc片段结合，因此可用SPA来取代第二抗体，这样就不受第一抗体动物种属来源的限制，同时，SPA荧光试剂制备简单，易于纯化和高度稳定。用其检测病毒抗原时，将培养在飞片上的病毒感染细胞用PBS轻洗2次，然后用标记的SPA荧光试剂覆盖，置4℃10～30分钟，用PBS洗二次后，将玻片反置于载玻片上，于荧光显微镜下观察结果。
另外，在链球菌细胞壁上，亦发现有类似SPA免疫功能的蛋白成分存在，通常将A群链球菌产生的称为Ⅱ型FcR，C群链球菌细胞壁产生的称为Ⅲ型FcR，G群链球菌产生的称为Ⅳ型FcR，兽疫链球菌产生的?Ⅴ型FcR，以上各型FcR均能与人及动物IgG的Fc段结合，如将其引入到免疫检测系统中，也可充当第二抗体应用。
上述的免疫荧光技术系传统方法，由于主要凭借手工操作，效率低，且对结果的判定在一定程度上可受主观因素的影响，所以近些年来又建立了几项相应的新方法：
①荧光激活细胞分类法(fluorescence activated cell sorter,FACS)，；
②时间分辨荧光免疫分析法(timeresolved fluoroimmunoassay,TrFIA)，是一项超微量物质免疫分析技术；主要特点是以镧系(稀土)元素铕(Eu3+)及其螯合物为示踪剂标记抗体或抗原，并利用时间分辨荧光光度计测量法排除检品中的非特异性荧光干扰；镧系标记物激发的光波长范围宽，辐射荧光的波长范围窄，有助于降低本底，荧光衰变时间长(100~1 000μs)，可用于检测蛋白质、肿瘤标志及病毒抗原等。
上海研卉生物科技有限公司
(一) 荧光抗体检测法(fluorescence antibody assay)
是应用FITC或罗丹明B(lissamine rhodamine B,RB200)等与提纯的抗体球蛋白相结合，制成所谓的荧光抗体，然后将其滴加于事先涂好被检抗原标本的载玻片上，经过一定时间染色，冲洗后，再用荧光显微镜做检查的一种方法(直接法)。如在被检标本中存在相应的微生物，则发生特异的抗原抗体反应，在荧光显微镜的视野内，不但可以看到典型形态的微生物，而且在微生物上还可以看到发出特异的草绿色荧光，由此可对被检标本作出诊断。
荧光抗体检测法在实际工作中还可根据自身条件，采用间接法。直接法操作虽比较简单，特异性较高，但敏感性稍低，适用于对相应微生物的直接检测。间接法的操作较复杂，但可以只用一种标记了荧光素的抗IgG的免疫球蛋白检测多种微生物，其敏感性较直接法约高10倍，但易产生非特异性荧光。另外，还有所谓的抗补体法，但在检验工作中应用的不多。
由于荧光抗体技术日趋完善，已成为一项既准确又快速的诊断技术，尤其是检测含微生物少，污染严重的标本时，更可显示出其独特的优点。本法主要用于炭疽、猪丹毒、布鲁氏菌病、鼻疽、沙门氏菌病、猪瘟、猪水泡病、马传贫、流乙脑炎等的快速诊断。另外，也可用以检查病原微生物在机体内的分布，血清抗体的滴度等。
(二) 吖啶橙免疫荧光法(AOFA)
用高倍稀释的吖啶橙溶液(1∶8万～1∶16万～1∶100万)与2～4单位的特异免疫血清等量混合后制成的诊断液，用其着染被检标本，如其中含有相应细菌，则与诊断液中的抗体结合，并产生特异的荧光，特别是细菌被抗体凝集成菌团后，用高稀释度的吖啶橙液仍可使细菌明显着色，然后以1 000r/min离心5～10分钟，取沉淀物倒于玻片上，用低倍荧光显微镜观察荧光菌团现象，当看到疏松，边缘不整齐，呈淡绿色的荧光菌团，大小在1mm以上者为阳性，然后用白金耳挑取荧光菌团作进一步的培养鉴定。
本法是在血清学的特异性和荧光法的敏感性基础上，与分离培养相结合而建立的一种方法，并且又通过低速离心沉淀和高度稀释的荧光色素的作用，加速了凝集，既能达到增大细菌凝块，又可减少类属抗原抗体交叉凝集反应的目的，并由于抗原-抗体的选择性凝集作用，而排除了标本中杂菌及杂质的干扰，并且能从荧光菌团中分离到活细菌，以作出确切的诊断，因而增加了本法的特异性、敏感性和快速性。根据荧光菌团作为初筛预报结果，可以在30分钟内完成，从荧光菌团分离培养至作出确切诊断，可在14～18小时内完成，比常规培养法提前20～30小时；用此法分离到细菌的阳性率，比常规法高3倍左右；此外本法不用提取Ig，与免疫血清混合、制成诊断液即可，方法简单，且易长期保存。本法已用于猪丹毒菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌及产气荚膜杆菌的检验。
(三) 荧光标记A蛋白(FITC-SPA)检测法
SPA是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种主要成分，它能与多种正常哺乳动物的IgG的Fc片段结合，而不影响该抗体分子的免疫活性，仍能与抗原起反应，当用荧光色素将其标记后，可制成特异的诊断制剂。在常规的荧光抗体技术间接染色法中，必须使用第二抗体(即抗球蛋白抗体)，但由于动物的种类不同，需要使用抗各种动物的第二抗体(如兔抗猪球蛋白抗体、兔抗马球蛋白抗体等)和抗各种动物球蛋白的荧光抗体，这样不仅操作复杂，同时也容易出现类属反应。而SPA能与多种哺乳动物的IgG的Fc片段结合，因此可用SPA来取代第二抗体，这样就不受第一抗体动物种属来源的限制，同时，SPA荧光试剂制备简单，易于纯化和高度稳定。用其检测病毒抗原时，将培养在飞片上的病毒感染细胞用PBS轻洗2次，然后用标记的SPA荧光试剂覆盖，置4℃10～30分钟，用PBS洗二次后，将玻片反置于载玻片上，于荧光显微镜下观察结果。
另外，在链球菌细胞壁上，亦发现有类似SPA免疫功能的蛋白成分存在，通常将A群链球菌产生的称为Ⅱ型FcR，C群链球菌细胞壁产生的称为Ⅲ型FcR，G群链球菌产生的称为Ⅳ型FcR，兽疫链球菌产生的?Ⅴ型FcR，以上各型FcR均能与人及动物IgG的Fc段结合，如将其引入到免疫检测系统中，也可充当第二抗体应用。
上述的免疫荧光技术系传统方法，由于主要凭借手工操作，效率低，且对结果的判定在一定程度上可受主观因素的影响，所以近些年来又建立了几项相应的新方法：
①荧光激活细胞分类法(fluorescence activated cell sorter,FACS)，；
②时间分辨荧光免疫分析法(timeresolved fluoroimmunoassay,TrFIA)，是一项超微量物质免疫分析技术；主要特点是以镧系(稀土)元素铕(Eu3+)及其螯合物为示踪剂标记抗体或抗原，并利用时间分辨荧光光度计测量法排除检品中的非特异性荧光干扰；镧系标记物激发的光波长范围宽，辐射荧光的波长范围窄，有助于降低本底，荧光衰变时间长(100~1 000μs)，可用于检测蛋白质、肿瘤标志及病毒抗原等。
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